Moleculair biologische onderzoeksmethodenspelen een grote rol in de moderne geneeskunde, criminalistiek en biologie. Dankzij vooruitgang op het gebied van DNA- en RNA-onderzoeken, kan een persoon het genoom van het organisme bestuderen, het veroorzakende agens van de ziekte identificeren, het gewenste nucleïnezuur in een mengsel van zuren herkennen, enz.
Al in de jaren 1970 en 1980, wetenschappersontcijfer het menselijk genoom. Deze gebeurtenis gaf een impuls aan de ontwikkeling van genetische manipulatie en moleculaire biologie. De studie van de eigenschappen van DNA en RNA leidde tot het feit dat het nu mogelijk is om deze nucleïnezuren te gebruiken om de ziekte te diagnosticeren, om genen te bestuderen.
Moleculair biologische diagnostische methodenbronmateriaal nodig hebben: vaker zijn het nucleïnezuren. Er zijn verschillende manieren om deze stoffen te isoleren uit de cellen van levende organismen. Elk van deze heeft zijn voor- en nadelen, en hiermee moet rekening worden gehouden bij het kiezen van een werkwijze voor het isoleren van nucleïnezuren in zijn zuivere vorm.
1. DNA verkrijgen van Marmur. De methode bestaat erin het mengsel van stoffen te behandelen met alcohol, waardoor zuiver DNA neerslaat. Het nadeel van deze methode is het gebruik van agressieve stoffen: fenol en chloroform.
2. DNA-isolatie volgens Boom. De belangrijkste stof die hier wordt gebruikt, is guanidine-thiocyanaat (GuSCN). Het draagt bij aan de depositie van deoxyribonucleïnezuur op gespecialiseerde substraten, van waaruit het later kan worden verzameld met behulp van een speciale buffer. GuSCN is echter een remmer van PTC en zelfs een klein deel daarvan, dat in het geprecipiteerde DNA is gevallen, kan het verloop van de polymerasekettingreactie beïnvloeden, die een belangrijke rol speelt bij het werken met nucleïnezuren.
3. Afzetting van onzuiverheden. De methode verschilt van de vorige omdat het geen onzuiverheden zijn die worden afgezet, maar niet de dehoxyribonucleïnezuurmoleculen zelf. Gebruik hiervoor ionenwisselaars. Het nadeel is dat niet alle stoffen kunnen bezinken.
4. Massascreening. Deze methode wordt gebruikt in gevallen waarin u geen nauwkeurige informatie over de samenstelling van het DNA-molecuul nodig hebt, maar u moet wel wat statistische gegevens opvragen. Dit wordt verklaard door het feit dat de structuur van een nucleïnezuur kan worden beschadigd wanneer het wordt behandeld met detergentia, in het bijzonder alkaliën.
Alle moleculair biologische onderzoeksmethoden zijn verdeeld in drie grote groepen:
1. Amplificatie (met behulp van een verscheidenheid aan enzymen). Dit omvat PCR - polymerasekettingreactie, die een grote rol speelt in veel van de diagnostische methoden.
2. Niet-versterking. Deze groep werkwijzen houdt direct verband met de werking van mengsels van nucleïnezuren. Voorbeelden zijn 3 soorten blotting, in situ hybridisatie, enz.
3. Methoden gebaseerd op herkenning van een signaal van een probemolecuul dat aan een specifieke DNA- of RNA-probe bindt. Een voorbeeld is het Hybride Capture System (hc2) hybridisatiesysteem.
Veel moleculaire diagnostische methoden omvatten het gebruik van een uitgebreid scala aan enzymen. De volgende worden het meest gebruikt:
1. Restrictie-enzym - "snijdt" het DNA-molecuul in noodzakelijke delen.
2. DNA-polymerase - synthetiseert een dubbelstrengs deoxyribonucleïnezuurmolecuul.
3. Reverse transcriptase (reverse transcriptase) wordt gebruikt om DNA op een RNA-sjabloon te synthetiseren.
4. DNA-ligase - verantwoordelijk voor de vorming van fosfodiesterbindingen tussen nucleotiden.
5. Exonuclease - verwijdert nucleotiden van de uiteinden van het deoxyribonucleïnezuurmolecuul.
Polymerase kettingreactie (PCR) is actiefgebruikt in moderne moleculaire biologie. Dit is een methode waarbij een enorm aantal kopieën kan worden verkregen uit een enkel DNA-molecuul (moleculen versterken).
De belangrijkste functies van PCR:
- diagnose van ziekten;
- klonen van DNA, genen.
Voor het uitvoeren van polymerase kettingreactiede volgende elementen zijn nodig: het originele DNA-molecuul, thermostabiele DNA-polymerase (Taq of Pfu), deoxyribonucleotide-fosfaten (bronnen van stikstofhoudende basen), primers (2 primers per 1 DNA-molecuul) en het buffersysteem zelf, waarin alle reacties kunnen worden uitgevoerd.
PCR bestaat uit drie stadia: denaturatie, primer-annealing en verlenging.
1. Denaturatie. Bij een temperatuur van 94-95 graden Celsius is er een breuk in de waterstofbruggen tussen twee DNA-ketens en als gevolg daarvan krijgen we twee enkelstrengige moleculen.
2. Gloeien van de primers. Bij een temperatuur van 50-60 graden Celsius zijn primers gehecht aan de uiteinden van enkelstrengs nucleïnezuurmoleculen van het complementariteitstype.
3. Verlenging. Bij een temperatuur van 72 graden vindt de synthese van dochter-dubbelstrengige moleculen van deoxyribonucleïnezuur plaats.
Moleculair biologische onderzoeksmethodenvereisen vaak kennis van de sequentie van nucleotiden in het deoxyribonucleïnezuurmolecuul. Sequencing wordt uitgevoerd om de genetische code te bepalen. Moleculaire diagnostiek van de toekomst zal gebaseerd zijn op de kennis die is opgedaan bij het bepalen van de volgorde van een persoon.
De volgende soorten sequencing worden onderscheiden:
